隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷進(jìn)步，源自人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）的腦類(lèi)器官已成為疾病模型中的熱門(mén)話題。腦類(lèi)器官有望為藥物篩選、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、神經(jīng)修復(fù)等領(lǐng)域帶來(lái)新的發(fā)展契機(jī)。

腦類(lèi)器官的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在下面兩個(gè)方面：

 

-與二維細(xì)胞培養(yǎng)相比

腦類(lèi)器官能體現(xiàn)出神經(jīng)元組織的復(fù)雜特征，比如皮質(zhì)層結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類(lèi)型多樣性等。

 

-與動(dòng)物模型相比

腦器官能保留患者個(gè)體的遺傳背景差異。此外，在小鼠皮層中植入的人腦類(lèi)器官可以發(fā)生血管化，以此供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，防止類(lèi)器官核中發(fā)生細(xì)胞壞死，并能將神經(jīng)軸突延伸到周?chē)乃拗鹘M織中。

2022年10月16日，曾解讀了斯坦福大學(xué)帕斯卡團(tuán)隊(duì)在Nature上發(fā)表的一篇重磅論文。該文以《Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids》為題，報(bào)道了一種人鼠混合大腦類(lèi)器官，為大腦神經(jīng)退行性疾病研究和新藥開(kāi)發(fā)提供了新的策略。（文章回顧：Nature重磅：人鼠混合大腦問(wèn)世，‘大腦類(lèi)器官’研究再添新進(jìn)展）

圖片來(lái)源：Nature 610, 319–326 (2022)

然而，目前腦類(lèi)器官的體內(nèi)研究集中在少數(shù)細(xì)胞的局部和急性反應(yīng)。移植的類(lèi)器官如何接受外部刺激，并在受體中產(chǎn)生慢性功能反應(yīng)，尚未得到證實(shí)。但現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)，無(wú)法支持同時(shí)在組織結(jié)構(gòu)和電生理兩個(gè)方面開(kāi)展縱向研究。

為了回答上述問(wèn)題，加州大學(xué)圣地亞哥分校Duygu Kuzum團(tuán)隊(duì)和波士頓大學(xué)Anna Devor團(tuán)隊(duì)開(kāi)展合作。研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合透明微電極陣列和雙光子成像技術(shù)，對(duì)移植到成年小鼠脾后皮質(zhì)（retrosplenial cortex）的人腦類(lèi)器官進(jìn)行縱向的多模態(tài)監(jiān)測(cè)。2022年12月26日，相關(guān)成果以《Multimodal monitoring of human cortical organoids implanted in mice reveal functional connection with visual cortex》為題目，發(fā)表在Nature communications雜志上。

圖片來(lái)源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

類(lèi)器官和微電極陣列共植入

可以對(duì)類(lèi)器官移植物進(jìn)行縱向監(jiān)測(cè)

Duygu Kuzum團(tuán)隊(duì)和Anna Devor團(tuán)隊(duì)曾合作開(kāi)發(fā)了一種透明的石墨烯微電極，實(shí)現(xiàn)了雙光子顯微鏡、光遺傳學(xué)刺激和皮層記錄在體內(nèi)的無(wú)串?dāng)_集成，相關(guān)成果于2018年發(fā)表在Nature communications雜志上。本文中，合作團(tuán)隊(duì)沿用了上述石墨烯微電極技術(shù)，以此來(lái)記錄移植的腦類(lèi)器官及周?chē)拗鹘M織的電信號(hào)和光學(xué)信號(hào)。

 

微電極陣列結(jié)構(gòu)示意圖

圖片來(lái)源：Nat Commun 9, 2035 (2018).

團(tuán)隊(duì)首先重組人體皮膚纖維細(xì)胞并獲得hiPSCs。誘導(dǎo)hiPSCs產(chǎn)生腦類(lèi)器官并培養(yǎng)7-9周后，根據(jù)尺寸和形狀，挑選其中的單個(gè)腦類(lèi)器官。團(tuán)隊(duì)選擇8-12周齡的NOD/SCID小鼠為受體，將人腦類(lèi)器官植入左脾后皮質(zhì)（left retrosplenial cortex, RSC），然后將石墨烯微電極置于其上。團(tuán)隊(duì)還利用3D打印技術(shù)制作了一種帽子，用于保護(hù)電極上的線路。術(shù)后恢復(fù)一周后，每?jī)芍軐?duì)小鼠進(jìn)行電生理檢測(cè)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)8-11周。

 

類(lèi)器官和微電極陣列共植入示意圖

圖片來(lái)源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

類(lèi)器官移植物對(duì)感覺(jué)刺激產(chǎn)生神經(jīng)反應(yīng)

研究團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)施加視覺(jué)刺激，研究腦類(lèi)器官能否對(duì)感官刺激產(chǎn)生功能性響應(yīng)，并記錄隨之而來(lái)的電響應(yīng)。團(tuán)隊(duì)提出假設(shè)，只有當(dāng)類(lèi)器官與宿主的視覺(jué)皮層組織整合后，才會(huì)開(kāi)始對(duì)視覺(jué)刺激產(chǎn)生反應(yīng)。

 

研究人員在實(shí)驗(yàn)小鼠的右眼前放置了一個(gè)光纖耦合的白光LED燈，該設(shè)備發(fā)出的光脈沖可以引發(fā)刺激誘導(dǎo)的電反應(yīng)。之后在類(lèi)器官以及接近視覺(jué)皮層的皮層通道中都清晰地檢測(cè)到視覺(jué)刺激反應(yīng)。從類(lèi)器官植入3周后，一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，研究人員在電極通道中確實(shí)觀察到了局部場(chǎng)電位（local field potentials, LFP），說(shuō)明類(lèi)器官植入物與周?chē)咏M織建立突出連接，并接受小鼠大腦的功能輸入。

刺激誘發(fā)類(lèi)器官和大腦皮層的局部場(chǎng)電位記錄

圖片來(lái)源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

感覺(jué)刺激下

多單元活動(dòng)發(fā)生調(diào)節(jié)

接著，團(tuán)隊(duì)研究了類(lèi)器官的放電活動(dòng)（spiking activity），是否受周?chē)由窠?jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)。由于多單元活動(dòng)（Multi-unit activity, MUA）可以反映局部神經(jīng)元放電情況，研究人員在0.5–3 kHz帶通濾波數(shù)據(jù)中對(duì)多單元活動(dòng)進(jìn)行評(píng)估。研究人員在腦類(lèi)器官和小鼠大腦皮層中，分別選擇了2個(gè)代表性的通道（類(lèi)器官：O1和O4，小鼠：C2和C7）。在所有通道中，都觀察到自發(fā)的多單元活動(dòng)。而且當(dāng)視覺(jué)刺激開(kāi)始后，在類(lèi)器官和小鼠大腦皮層中，都觀察到多單元活動(dòng)的增加。

類(lèi)器官和大腦皮層的多單元活動(dòng)

圖片來(lái)源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

與宿主皮層相比

移植的類(lèi)器官對(duì)麻醉的反應(yīng)不同

研究人員進(jìn)一步假設(shè)，類(lèi)器官移植物主要接受局部信號(hào)輸入，而像來(lái)自丘腦核和神經(jīng)調(diào)節(jié)中心的長(zhǎng)距離投射則不存在。由于麻醉已被證明會(huì)影響到大腦皮層的長(zhǎng)距離投射活動(dòng)，因此團(tuán)隊(duì)用1.5%異氟烷麻醉小鼠后，觀察類(lèi)器官與周?chē)拗髌拥淖园l(fā)神經(jīng)活動(dòng)的變化。

 

與周?chē)べ|(zhì)相比，異氟醚麻醉導(dǎo)致類(lèi)器官神經(jīng)元活性顯著降低。而且在清醒狀態(tài)下，類(lèi)器官活性通常低于周?chē)?，?duì)特定頻帶也沒(méi)有選擇性。結(jié)果顯示，類(lèi)器官受局部神經(jīng)元支配，但缺乏長(zhǎng)程投射。

用1.5%異氟烷麻醉小鼠后，

分析類(lèi)器官和小鼠大腦的局部場(chǎng)電位

圖片來(lái)源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

類(lèi)器官移植物體內(nèi)血管化

并與周?chē)べ|(zhì)整合

研究人員運(yùn)用體內(nèi)雙光子成像和免疫染色技術(shù)，對(duì)類(lèi)器官移植物與周?chē)拗鹘M織的整合情況進(jìn)行了觀察。

血管化一直是類(lèi)器官構(gòu)建中的難點(diǎn)問(wèn)題，在類(lèi)器官植入的9到10周后，對(duì)小鼠注射血管內(nèi)示蹤劑Alexa Fluor 680葡聚糖。通過(guò)雙光子顯微鏡，發(fā)現(xiàn)類(lèi)器官植入?yún)^(qū)域都含有小鼠脈管系統(tǒng)。而且與周?chē)べ|(zhì)相比，類(lèi)器官區(qū)域的血管密度較低。

 

類(lèi)器官血管化的體內(nèi)成像

圖片來(lái)源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

在類(lèi)器官植入后的8到11周處死動(dòng)物，并對(duì)大腦進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)和分析人細(xì)胞（NM-95）、內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞（CD31）和神經(jīng)元核（NeuN）。類(lèi)器官植入?yún)^(qū)域顯示NM-95陽(yáng)性，說(shuō)明植入細(xì)胞在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中都存活了下來(lái)。而且，部分NM-95陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞遷移。與雙光子顯微鏡觀察結(jié)果一致的是，研究人員也觀察到了穿過(guò)類(lèi)器官植入物的血管內(nèi)皮細(xì)胞。通過(guò)NeuN和蘇木精共染，發(fā)現(xiàn)類(lèi)器官移植物有約48%的細(xì)胞具有神經(jīng)元表型。

類(lèi)器官血管化的免疫染色

圖片來(lái)源：Nat Commun 13, 7945 (2022)

下一步的研究方向

本項(xiàng)研究中開(kāi)發(fā)的實(shí)驗(yàn)裝置，為研究發(fā)育性腦疾病背后的人類(lèi)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)水平功能障礙提供了前所未有的機(jī)會(huì)。接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)需要構(gòu)建神經(jīng)疾病模型，整合鈣成像分析，并對(duì)類(lèi)器官神經(jīng)元的放電活動(dòng)進(jìn)行可視化。

Duygu Kuzum在接受采訪時(shí)表示，未來(lái)干細(xì)胞技術(shù)一定會(huì)和神經(jīng)記錄技術(shù)結(jié)合，用于多個(gè)腦疾病研究場(chǎng)景。比如：在生理?xiàng)l件下構(gòu)建疾病模型，基于患者來(lái)源類(lèi)器官驗(yàn)證特定治療方式，評(píng)估類(lèi)器官修復(fù)特定丟失、退化或受損腦區(qū)的潛力。

雖然目前人腦類(lèi)器官的功能過(guò)于原始，但隨著人腦類(lèi)器官移植相關(guān)研究的增加，類(lèi)器官移植是否會(huì)影響動(dòng)物腦功能或者動(dòng)物行為值得關(guān)注?！缎汕蜥绕?》的編劇，是不是可以考慮一下，融入當(dāng)下這個(gè)熱門(mén)話題？

參考資料：

1.Revah, O., Gore, F., Kelley, K.W. et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature 610, 319–326 (2022).

2.Wilson, M.N., Thunemann, M., Liu, X. et al. Multimodal monitoring of human cortical organoids implanted in mice reveal functional connection with visual cortex. Nat Commun 13, 7945 (2022).

3. Thunemann, M., Lu, Y., Liu, X. et al. Deep 2-photon imaging and artifact-free optogenetics through transparent graphene microelectrode arrays. Nat Commun 9, 2035 (2018).

4.https://medicalxpress.com/news/2022-12-human-brain-organoids-implanted-mouse.html