該研究首次在單細(xì)胞精度定義了肝癌的五種免疫微環(huán)境亞型（TIMELASER），探究了其細(xì)胞組成、空間分布、基因組特征和趨化因子受體-配體網(wǎng)絡(luò)，首次全面揭示腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TAN)的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證CCL4+、PD-L1+ TAN兩個(gè)關(guān)鍵亞群的促腫瘤機(jī)制，最終通過(guò)構(gòu)建小鼠肝癌模型，從In vitro，Ex vivo，In vivo三個(gè)層面，逐步深入地證明靶向腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞有望形成新的肝癌免疫治療方案，這些成果為肝癌的基礎(chǔ)研究和臨床診療提供了關(guān)鍵信息。

圖1 本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

劃分肝癌“免疫微環(huán)境”的五種亞型

每名患者的癌癥細(xì)胞所處的免疫微環(huán)境都存在差異，要想實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的免疫調(diào)節(jié)治療，就要弄清楚癌癥的免疫微環(huán)境可以分成幾種類型。因此，腫瘤的免疫微環(huán)境研究是個(gè)很重要的研究方向，不過(guò)在單細(xì)胞層面上，此前還沒(méi)有人進(jìn)行該精度的測(cè)序研究、染色研究等。

北大團(tuán)隊(duì)根據(jù)免疫細(xì)胞的狀態(tài)，首次在單細(xì)胞層面的精度上，總結(jié)提出五種免疫微環(huán)境，分別是：免疫激活型、髓系富集免疫抑制型、基質(zhì)富集免疫抑制型、免疫排斥型和免疫駐留型。其中，第二種和第三種微環(huán)境同為免疫抑制型，但發(fā)揮作用的免疫細(xì)胞分別為髓系細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。該環(huán)境會(huì)抑制、阻止免疫細(xì)胞正常工作，使得免疫細(xì)胞無(wú)法吞噬殺死癌細(xì)胞，讓癌細(xì)胞在我們體內(nèi)“為所欲為”。

所以，針對(duì)免疫抑制型環(huán)境，我們需要進(jìn)一步探究，是什么讓我們的免疫細(xì)胞“罷工”了呢？團(tuán)隊(duì)針對(duì)第二種髓系富集免疫抑制型微環(huán)境進(jìn)行深入探究，發(fā)現(xiàn)原來(lái)是具有一定免疫功能的中性粒細(xì)胞發(fā)生了“叛變”。

圖2 腫瘤免疫微環(huán)境的5種亞型（TIMELASER）示意圖

百萬(wàn)細(xì)胞數(shù)據(jù)揭示中性粒細(xì)胞的“叛變”

什么是中性粒細(xì)胞？中性粒細(xì)胞是人體最豐富的粒細(xì)胞類型，占人體所有白細(xì)胞的40%至70%，具備強(qiáng)大的吞噬能力，是宿主抵抗入侵病原體的第一道防線，是實(shí)打?qū)嵉暮眉?xì)胞、戰(zhàn)斗士。按理說(shuō)，它應(yīng)該幫著免疫細(xì)胞一起吞噬殺滅入侵的癌細(xì)胞，就像此前的觀點(diǎn)一直認(rèn)為的那樣。

但是，本次實(shí)驗(yàn)分析了3萬(wàn)多個(gè)中性粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有些中性粒細(xì)胞在癌細(xì)胞周圍不僅不好好進(jìn)攻，反而“策反”免疫細(xì)胞加入“罷工”行列，眼睜睜地看著癌細(xì)胞生長(zhǎng)。找到這個(gè)原因，就提供了一個(gè)新的改善免疫微環(huán)境的方向，也就是今后肝癌治療的新方向。

那么，為什么此前都未發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在免疫微環(huán)境中發(fā)生了“叛變”呢？首先，這是因?yàn)橹行粤＜?xì)胞在微環(huán)境中的含量較少，如果不進(jìn)行單細(xì)胞精度的觀察，極容易忽略。第二，還因?yàn)橹行粤＜?xì)胞是一類非常脆弱的細(xì)胞，通常認(rèn)為其在體內(nèi)進(jìn)入外周血（即骨髓以外的血液）后存活不超過(guò)一周，體外存活不超過(guò)24小時(shí)。所以，提取和保存難度很大。

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)中性粒細(xì)胞的成功分析，其一得益于“無(wú)抗體富集”策略，即全盤研究細(xì)胞的策略。對(duì)研究團(tuán)隊(duì)來(lái)說(shuō)，這是一個(gè)“大膽的決定”。因?yàn)橄胍鰺o(wú)偏差的研究就要把所有的細(xì)胞都仔細(xì)分析。團(tuán)隊(duì)拿到了100多萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，其中的數(shù)據(jù)處理比普通的幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的難度要上很大的層級(jí)，為了實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的分析結(jié)果，數(shù)據(jù)分析方案經(jīng)過(guò)了多次優(yōu)化和推倒重來(lái)。

研究中遇到最大的困難就是細(xì)胞分群。當(dāng)團(tuán)隊(duì)拿到100多萬(wàn)個(gè)數(shù)據(jù)后，要判斷出每一個(gè)細(xì)胞的類屬。判斷的依據(jù)在于細(xì)胞的基因，而每一個(gè)細(xì)胞里邊平均約有2000多個(gè)基因。同時(shí)細(xì)胞分群要跟已發(fā)表數(shù)據(jù)緊密結(jié)合，既要閱讀大量文獻(xiàn)，確定已經(jīng)報(bào)道的細(xì)胞類群，又要對(duì)多個(gè)全新的細(xì)胞亞群進(jìn)行首次定義。因此，一定要非常嚴(yán)謹(jǐn)和細(xì)致。經(jīng)過(guò)一年多的前期數(shù)據(jù)分析，團(tuán)隊(duì)才把這100多萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的類別定出來(lái)。

圖3 中性粒細(xì)胞亞群的組織分布、發(fā)育軌跡和癌種富集

最終，團(tuán)隊(duì)得到了涵蓋了13個(gè)大類的89個(gè)小亞群，文章中首次發(fā)現(xiàn)了之前未報(bào)道的11種中性粒細(xì)胞。這次分出的89個(gè)亞群，也為今后癌癥的精準(zhǔn)治療提供了分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)，不僅是對(duì)肝癌，對(duì)所有的癌癥來(lái)說(shuō)，都很有意義。

走在世界前列：“細(xì)胞等不了，熬夜是常態(tài)”

“我們這個(gè)工作能夠走在世界前列，除了在實(shí)驗(yàn)方法的進(jìn)步以外，還因?yàn)槲覀儗?shí)驗(yàn)和臨床有非常好的配合。”張寧教授回憶團(tuán)隊(duì)進(jìn)行科研攻關(guān)時(shí)的密切配合感慨道，“因?yàn)槲覀兊募?xì)胞要根據(jù)病人做手術(shù)的需要來(lái)，所以我們和臨床配合得非常緊密。晚上八九點(diǎn)鐘了，薛老師他們就在手術(shù)房外等著，臨床組的樣本一下來(lái)，實(shí)驗(yàn)組馬上就去分細(xì)胞，一直分到夜里十一二點(diǎn)鐘那都是常有的，熬夜也是常態(tài)。因?yàn)檫@個(gè)細(xì)胞是等不了的，只要三個(gè)小時(shí)之后，細(xì)胞就見(jiàn)不著了。要做100多個(gè)人，100多萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，這樣的一個(gè)龐大的數(shù)據(jù)樣本，那是要有奉獻(xiàn)精神的。這就是我們北大的優(yōu)勢(shì)，北大各個(gè)學(xué)科都很強(qiáng)、都很齊，同時(shí)我們的老師們有奉獻(xiàn)精神，這是我印象很深的。”

本次實(shí)驗(yàn)由來(lái)自北京大學(xué)第一醫(yī)院的張寧教授課題組、北京大學(xué)BIOPIC（生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心）的張澤民教授課題組和北京大學(xué)人民醫(yī)院的朱繼業(yè)教授課題組聯(lián)合完成。張寧教授課題組牽頭提出思路想法并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作，朱繼業(yè)教授課題組提供臨床樣本，張澤民教授課題組提供生物信息分析技術(shù)。這樣三個(gè)課題組，體現(xiàn)了現(xiàn)代科學(xué)研究的特點(diǎn)：一個(gè)大的科學(xué)問(wèn)題需要多個(gè)團(tuán)隊(duì)合作完成，而北大則恰好提供了優(yōu)勢(shì)合作的平臺(tái)。

為今后肝癌乃至癌癥治療提供關(guān)鍵入口

本次研究的另一大創(chuàng)新處在于，課題組在數(shù)據(jù)分析與動(dòng)物驗(yàn)證方面結(jié)合得非常好。張寧介紹文章受到了學(xué)術(shù)界很多關(guān)注：“我們把醫(yī)療出來(lái)的病例進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之后，還通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，數(shù)據(jù)分析的結(jié)果和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的匹配達(dá)成了非常好的契合。”這更加強(qiáng)有力地說(shuō)明了研究的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。

圖4 Anti-Ly6G抗體去除中性粒細(xì)胞可以有效緩解小鼠肝癌生長(zhǎng)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出的確鑿數(shù)據(jù)，團(tuán)隊(duì)提出，中性粒細(xì)胞可以是肝癌甚至是癌癥治療中的一個(gè)重要靶點(diǎn)。這就為了今后肝癌乃至癌癥治療提供了一個(gè)非常重要且關(guān)鍵的入口，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行研究和突破，關(guān)于肝癌會(huì)有更好的治療方法和診斷方法。

附：薛瑞棟（北京大學(xué)第一醫(yī)院）、張啟明（北京大學(xué)BIOPIC）、曹奇（北京大學(xué)第一醫(yī)院）、孔瑞瑞（北京大學(xué)第一醫(yī)院）和向驍（北京大學(xué)人民醫(yī)院）是該論文的并列第一作者。張寧（北京大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤轉(zhuǎn)化中心）、張澤民（北京大學(xué)BIOPIC）和朱繼業(yè)（北京大學(xué)人民醫(yī)院）為共同通訊作者。該研究得到國(guó)家自然基金、“十三五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、基礎(chǔ)科學(xué)中心等多項(xiàng)國(guó)家科學(xué)基金的支持和資助。

來(lái)源 北京大學(xué)