線粒體是細(xì)胞的動力來源，影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、增殖、死亡的關(guān)鍵信號通路。由于線粒體的動態(tài)行為以及與其他細(xì)胞器的豐富相互作用，熒光顯微鏡的發(fā)展特別推動了線粒體研究。線粒體內(nèi)膜（inner membrane，IM）向內(nèi)凹陷形成許多層狀或管狀的內(nèi)嵴，其間距通常小于100nm，導(dǎo)致傳統(tǒng)熒光顯微鏡無法觀察到其內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，基于固定樣本的電子顯微鏡技術(shù)一直作為捕捉線粒體膜結(jié)構(gòu)的主流工具。近年來，活細(xì)胞線粒體納米成像已從原理驗證發(fā)展成為一種結(jié)構(gòu)和功能研究的可行方法。其中，受激發(fā)射損耗納米顯微鏡（STED）和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM）已被報道用于活細(xì)胞的線粒體內(nèi)嵴成像。然而，目前線粒體納米結(jié)構(gòu)的可視化大多局限于癌細(xì)胞的二維（2D）單色成像，正交策略尚未建立，且STED圖像采集會受到細(xì)胞器的光損傷或快速光漂白的影響，很難觀察到原生狀態(tài)下的線粒體形態(tài)。

北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳知行研究員課題組在Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.雜志上發(fā)表了題為“Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain” 的研究論文，并被選為封面文章。該研究報道了一款適用于STED納米顯微鏡的線粒體內(nèi)嵴染料PK Mito Orange （PKMO），其具有優(yōu)秀的光穩(wěn)定性和顯著降低的光毒性，可實現(xiàn)在永生化哺乳動物細(xì)胞系、原代細(xì)胞和組織中的長時程、超分辨率的線粒體動力學(xué)成像，單個線粒體的3D-STED成像，以及多色STED成像（圖1）。

圖1：PKMO標(biāo)記的HeLa細(xì)胞線粒體內(nèi)嵴、微絲蛋白（SPY650FastAct）和細(xì)胞核（SPY505 DNA）的多色活細(xì)胞成像圖

該研究利用環(huán)辛四烯（COT）偶聯(lián)策略降低染料光毒性，同時精確調(diào)控光譜使得染料與561nm激發(fā)光和775nm STED光完美兼容。PKMO染色后的細(xì)胞在STED納米顯微鏡下，可觀察到整個細(xì)胞中具有高度有序的層狀內(nèi)嵴網(wǎng)絡(luò)，并以低至50nm的光學(xué)分辨率捕獲了單個線粒體內(nèi)嵴形態(tài)和線粒體分裂、融合以及管狀發(fā)生等動態(tài)過程。PKMO因其溫和的性質(zhì)和優(yōu)秀的光穩(wěn)定性可實現(xiàn)活細(xì)胞中單個線粒體的3D STED重建。PKMO除了可應(yīng)用于癌細(xì)胞和永生化的細(xì)胞系以外，也可實現(xiàn)對光毒性極為敏感的原代細(xì)胞和組織的超分辨成像。PKMO展示了在COS-7、HeLa、U-2 OS細(xì)胞系以及原代脂肪細(xì)胞、原代神經(jīng)元、原代胰島組織中的內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)及其動力學(xué)過程。

線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了線粒體亞區(qū)室，它們有著不同的用途。多色納米顯微鏡技術(shù)因其可提供較高的分辨率和更多的時空信息，將取代傳統(tǒng)的生化分析或電子顯微技術(shù)成為一個強有力的新型分析手段。如圖2所示，PKMO展示了與線粒體IM與線粒體DNA（mtDNA）、線粒體外膜、crista junction、微管蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多色超分辨成像。多色活細(xì)胞STED成像可以揭示生物分子的不同線粒體定位以及線粒體在全細(xì)胞內(nèi)的互作網(wǎng)絡(luò)；可提供與要求更高的免疫電鏡技術(shù)相似的信息，且可繪制有關(guān)結(jié)構(gòu)和生物分子動力學(xué)的更多信息。

圖2：線粒體內(nèi)嵴與mtDNA、線粒體外膜、cristajunction、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架的多色STED成像

內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)的缺陷與細(xì)胞呼吸功能障礙有關(guān)，并與神經(jīng)退行性疾病或心臟病有關(guān)。作者還展示了不同線粒體蛋白缺陷型的細(xì)胞系與野生細(xì)胞系的內(nèi)嵴形態(tài)的差異。在未來，利用PKMO對活細(xì)胞進行超分辨成像有望取代傳統(tǒng)耗時費力的電鏡制樣，成為線粒體結(jié)構(gòu)功能研究的日常工具。

綜上，作者團隊報道了一種兼容活細(xì)胞STED成像的、高亮度、低光毒性的新型線粒體探針。PKMO可在永生化的哺乳動物細(xì)胞系、原代細(xì)胞或組織中實現(xiàn)長時間、超分辨率的內(nèi)膜動力學(xué)記錄。PKMO的光穩(wěn)定性和光毒性為活細(xì)胞線粒體的3D STED顯微鏡成像打開了大門。同時，PKMO可兼容綠色和遠(yuǎn)紅熒光標(biāo)記物，實現(xiàn)多色超分辨率下的線粒體亞結(jié)構(gòu)的多組分分析。多色STED顯微鏡可在100nm分辨率下捕獲線粒體與不同細(xì)胞成分的相互作用，BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，以及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中的內(nèi)嵴表型。因此，這項工作提供了一個多功能的工具，用于以多路復(fù)用的方式研究線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和動力學(xué)。