2022年9月14日，國際藥物化學(xué)權(quán)威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》在線發(fā)表了華東師范大學(xué)陳益華/易正芳研究員團(tuán)隊(duì)合作的最新研究成果“Discovery of a Novel Potent STAT3 Inhibitor HP590 with Dual p-Tyr705/Ser727 Inhibitory Activity for Gastric Cancer Treatment”。這是繼4月27日陳益華團(tuán)隊(duì)在同期刊發(fā)表“Discovery of 2-Amino-3-cyanothiophene Derivatives as Potent STAT3 Inhibitors for the Treatment of Osteosarcoma Growth and Metastasis”后在STAT3抑制劑研究方面取得的又一次重要突破。

圖1.文章標(biāo)題

近年來，靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子已成為開發(fā)新型抗腫瘤藥物的熱門研究領(lǐng)域之一。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，其常被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中異常激活，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)過程，并與多種癌癥的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，在過去二十年，STAT3作為潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)受到大量藥物研究科學(xué)家和制藥公司的青睞。目前，已有少量直接STAT3抑制劑進(jìn)入臨床用于不同癌癥治療的研究，但這些抑制劑仍存在體內(nèi)抗腫瘤效果不足、成藥性較差以及安全性不夠等問題，更重要的是，大部分報(bào)道的STAT3抑制劑只能抑制STAT3的Tyr705位點(diǎn)磷酸化，而不能抑制STAT3另一個(gè)氨基酸殘基Ser727的磷酸化。大量研究表明，STAT3的激活主要涉及兩個(gè)氨基酸殘基Tyr705和Ser727的磷酸化，兩者在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，Tyr705磷酸化主要介導(dǎo)STAT3的核轉(zhuǎn)錄功能，而Ser727磷酸化主要介導(dǎo)STAT3的線粒體氧化磷酸化功能，兩者在多種腫瘤中高表達(dá)且均能促進(jìn)腫瘤的惡性增殖或?qū)е缕渌[瘤發(fā)展過程。鑒于STAT3 Ser727磷酸化在多種腫瘤中同樣發(fā)揮著重要作用，陳益華研究員團(tuán)隊(duì)與其合作者易正芳研究員團(tuán)隊(duì)致力于開發(fā)能同時(shí)抑制Tyr705和Ser727磷酸化的新型STAT3抑制劑。

圖2.STAT3雙磷酸化抑制劑的篩選策略及苗頭化合物1a的發(fā)現(xiàn)

本研究中，作者們以STAT3雙位點(diǎn)磷酸化在胃癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的重要角色為背景，基于STAT3雙位點(diǎn)磷酸化在腫瘤細(xì)胞中介導(dǎo)不同生物學(xué)功能建立了全新的STAT3雙磷酸化抑制劑的高通量篩選實(shí)驗(yàn)，即表征STAT3 p-Tyr705抑制活性的STAT3依賴性熒光素酶實(shí)驗(yàn)（Luciferase reporter assay）和用于表征p-Ser727抑制活性的ATP抑制實(shí)驗(yàn) (ATP inhibition assay)。隨后，通過篩選大量化合物，作者獲得一個(gè)能在微摩爾水平顯著抑制STAT3熒光素酶活性、胃癌細(xì)胞中ATP生成以及多株胃癌細(xì)胞增殖的理想苗頭化合物1a（圖2）。為了進(jìn)一步提高苗頭化合物1a的生物活性，作者們進(jìn)行了理性的藥物化學(xué)設(shè)計(jì)與構(gòu)效該系研究，最終導(dǎo)致了具有低納摩爾抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物HP590的發(fā)現(xiàn)（圖3）。同時(shí)，作者們還在本文中總結(jié)了這類三芳香雜環(huán)STAT3雙磷酸化抑制劑的構(gòu)效關(guān)系，其具體內(nèi)容如圖4所示。

圖3.從苗頭化合物到先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化過程

圖4.改造化合物的構(gòu)效關(guān)系總結(jié)

接下來的工作中，作者們對(duì)先導(dǎo)化合物HP590進(jìn)行了系統(tǒng)的靶點(diǎn)驗(yàn)證和體內(nèi)外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)。首先，作者們?cè)赪B實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證先導(dǎo)化合物HP590是否能在腫瘤細(xì)胞中抑制STAT3的雙位點(diǎn)磷酸化。結(jié)果顯示，HP590能在低納摩爾濃度下以時(shí)間梯度和濃度梯度依賴的方式抑制多株胃癌細(xì)胞中的STAT3雙位點(diǎn)磷酸化，而對(duì)STAT3蛋白本身沒有顯著影響。隨后，作者們通過分子對(duì)接（docking）、微量熱泳動(dòng)儀（MST）、細(xì)胞熱轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（CETSA）實(shí)驗(yàn)證明HP590能以高親和性和選擇性的結(jié)合到STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域，而對(duì)與其高度同源的STAT1和STAT5無結(jié)合作用。另外，作者們還發(fā)現(xiàn)HP590對(duì)STAT3上游酪氨酸激酶和絲氨酸激酶無明顯的抑制作用。這些證據(jù)表明HP590是一個(gè)直接的STAT3抑制劑，其可以通過靶向STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域顯著抑制其雙位點(diǎn)磷酸化（圖5）。緊接著，作者們還通過調(diào)查HP590對(duì)胃癌細(xì)胞中STAT3下游、STAT3轉(zhuǎn)入細(xì)胞核以及線粒體氧化磷酸化的抑制效果，結(jié)果顯示HP590能同時(shí)抑制p-Tyr705和p-Ser727分別介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄功能和線粒體氧化磷酸化功能，再次表明HP590是一個(gè)STAT3雙位點(diǎn)磷酸化抑制劑。此外，作者還對(duì)HP590的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步的評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示HP590具有較優(yōu)的口服生物利用度以及體內(nèi)代謝穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)多種CYP450酶無明顯抑制作用。

圖5.HP590通過選擇性靶向STAT3抑制其雙位點(diǎn)磷酸化

最后，作者們對(duì)HP590的體內(nèi)外抗胃癌細(xì)胞增殖活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，HP590能選擇性抑制胃癌細(xì)胞的增殖而對(duì)低表達(dá)STAT3雙磷酸化的正常細(xì)胞無明顯抑制，另外，HP590相比于陽性化合物BBI608能更加顯著的抑制多株胃癌細(xì)胞的克隆形成以及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡(圖6)。同時(shí)，作者們還發(fā)現(xiàn)HP590對(duì)敲低STAT3的胃癌細(xì)胞無明顯抑制，再次表明STAT3是HP590在體外發(fā)揮抗腫瘤活性的主要靶點(diǎn)（圖6）。體內(nèi)研究表明，口服HP590顯著抑制MKN45異種模型的增殖，而且通過對(duì)HP590治療后的腫瘤組織分析發(fā)現(xiàn)，HP590在體內(nèi)同樣顯著抑制STAT3雙位點(diǎn)磷酸化和下游基因的表達(dá)，表明STAT3是HP590在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤活性的主要靶點(diǎn)（圖7）。重要的是，HP590在治療過程中對(duì)小鼠體重和主要器官無明顯影響，表明HP590是一類安全有效的STAT3雙磷酸化抑制劑，可為未來胃癌的治療提供新的可能。

總結(jié):該研究報(bào)道了一種全新的STAT3雙磷酸化抑制劑的高通量篩選策略，闡述了從苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)到先導(dǎo)化合物改造和構(gòu)效關(guān)系研究過程，通過靶點(diǎn)的驗(yàn)證以及體內(nèi)外的抗腫瘤活性研究確定HP590可作為一類新型的選擇性STAT3雙位點(diǎn)磷酸化抑制劑，為下一代STAT3抑制劑開發(fā)提供新的思路。

圖6.HP590在體外顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖

圖7.HP590在體內(nèi)通過抑制STAT3雙位點(diǎn)磷酸化顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖

該文章以華東師范大學(xué)陳益華研究員和易正芳研究員為共同通訊作者，華東師范大學(xué)博士生何朋和博士生繆穎為共同第一作者，另外，該研究獲得華東師范大學(xué)劉明耀教授的大力支持。

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.2c00413

“精準(zhǔn)藥物”公眾號(hào)由暨南大學(xué)藥學(xué)院張章博士創(chuàng)建。張章博士主要從事：1）小分子靶向抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)、作用機(jī)制和成藥性研究；2）基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的疾病和藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)研究。作為主要完成人，團(tuán)隊(duì)開發(fā)的4個(gè)激酶抑制劑先后轉(zhuǎn)讓給企業(yè)進(jìn)行后期開發(fā)，其中1個(gè)已上市（奧雷巴替尼），1個(gè)報(bào)生產(chǎn)，1個(gè)在I期臨床，1個(gè)在臨床前研究階段。實(shí)驗(yàn)室具備完善的體內(nèi)外藥效、機(jī)制、成藥性、靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和確證等技術(shù)平臺(tái)；支撐和推動(dòng)了多個(gè)企業(yè)靶向抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)、成藥性評(píng)價(jià)、新適應(yīng)癥和機(jī)制等研究。